叶绿素a分光光度法操作步骤

叶绿素a分光光度法操作步骤：

将一定量水样用玻璃纤维滤膜过滤，以90%丙酮为提取液研磨提取水中浮游植物的叶绿素，离心后测定其750nm、664nm、647nm、630nm 波长下的吸光度值，计算叶绿素a 的含量。

测定叶绿素的具体操作步骤如下：

（1） 过滤：

（2） 研磨：

将样品滤膜放置于研磨装置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊状。补加3~4mL丙酮溶液，继续研磨，并重复1~2次，保证充分研磨5min以上。将破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，用丙酮溶液冲洗研钵及研磨杵，一并转移入离心管中，定容至10Ml。

（3） 浸泡提取：

将离心管中的研磨提取液充分震荡混匀后，用铝箔包好，放置于4摄氏度下避光浸泡提取2小时以上。

（4） 离心：

将离心管放入离心机，以3000~4000r/min的速度离心10min，然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素a的丙酮提取液待测。

（5） 空白试样的配置：

用实验用水按照与试样的制备相同的步骤进行实验室空白试样的制备。

（6） 测定：

将试样转移至比色皿中，以丙酮溶液为参比溶液，于波长750nm、664nm、647nm、630nm处测吸光度。

国内外方法中的各种实验条件总结如下：

（1）提取试剂：

除热乙醇方法，国内外标准方法均采用90%丙酮作为提取试剂。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻类细胞中的叶绿素a，而且不产生其它衍生物。丙酮是国际上提取叶绿素的试剂。

（2）滤膜：

除《水和废水监测分析方法（第四版）》采用乙酸纤维滤膜外，均采用玻璃纤维滤膜。

（3）样品保存方法：

样品的保存条件各种方法略有不同，但水样采集后均保证4℃冷藏保存，样品滤膜可冷冻保存。而且叶绿素a 测定样品滤膜冷冻后再研磨，可提高提取效率。如采样后不立刻测定，-18℃下冰冻，再于室温条件下融解，利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶涨，使胞壁结构破碎引起叶绿素溶出。

（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：

目前国内也有很多文献报道了对上述叶绿素a提取方法的改进研究，如延长提取时间。水利部行业标准《叶绿素a的测定分光光度法》（SL88-2012）叶绿素测定的主要操作是低温反复冷冻提取-避光冷藏浸泡-离心，在EPA的446.0的基础上改进了提取方法。考虑到不同地区仪器设备的能力差异，-40℃的超低温冰箱不是所有的环境监测部门均具备的仪器设备，所以将样品滤膜的冷冻作为辅助的提取条件。

（5）计算公式及波长：

关于计算方法，主要有三色法和单色法，三色法主要考虑了叶绿素b 和叶绿素c 对测定的干扰，测定的是表观叶绿素a 的含量（包括叶绿素a 与脱镁叶绿素a 之和），单色法考虑脱镁叶绿素a 的干扰.从方法的简便性来说，三色法操作简单，产生误差几率小，耗时比单色法短。